无菌液体培养基制备：高效灭菌技术

关键词：液体培养基 微生物 芽孢 细菌 高压蒸汽灭菌 温度 压力 过滤除菌 滤菌器 滤膜 无菌操作 紫外线灭菌 化学灭菌

液体培养基是微生物学、细胞生物学等领域中常用的一种培养基形式，与固体培养基相对应，它主要呈液态，可以通过通气或振荡的方式培养微生物或动植物细胞。液体培养基在配制过程中容易受到细菌、真菌、芽孢等微生物的污染，从而影响实验细胞的生长繁殖。因此需采取有效方式对液体培养基充分灭菌，以保证实验细胞的正常生长。

一、高压蒸汽灭菌

高压蒸汽灭菌是实验室中常用的灭菌方法之一，适用于耐高温的物体、器皿及培养基的灭菌。其原理是利用高温高压的蒸汽来破坏微生物的细胞结构，从而达到灭菌的目的。

操作步骤如下：

1.准备：将配制好的液体培养基分装至合适的容器如三角瓶或试管中，分装好的培养基用棉塞、纱布或无菌透气封口膜等包扎密封，放入消毒筐中等待灭菌。注意培养基不要装得太满，一般装量不超过容器的2/3即可，以防在灭菌过程中因容器内外压力不平衡而导致培养基溢出；容器与容器之间应留有空隙，不宜太过拥挤，保证蒸汽可以在容器之间流通。

2.装锅：将消毒筐放入压力蒸汽灭菌锅内，关紧锅门，防止因锅内蒸汽温度压力过高而发生安全事故。打开蒸汽进汽阀门，开始灭菌。

3.加热升温：调节灭菌锅的排汽阀，使锅内压力及温度逐渐升高至规定的灭菌要求。在蒸汽压力为0.105MPa（约1.05大气压）时，锅内温度可达到121℃。

4.灭菌：在达到灭菌规定的温度和压力后，保持一段时间，通常为121-124℃，灭菌30min左右，以确保细菌、真菌、芽孢等微生物被杀灭。记录灭菌的温度及时间，做到可追溯。

5. 降压取物：灭菌结束后，关闭蒸汽进汽阀门，调节排汽阀或通过自然降压的方式使锅内压力降至零，打开灭菌锅门取出培养基。注意从锅内取出物品时应戴好手套，防止烫伤。

图示为高压蒸汽灭菌

二、过滤除菌

对于一些不耐热的液体培养基，如某些植物生长调节剂或有机物，温度过高容易分解，可以采用过滤除菌的方法对培养基进行处理。

操作步骤如下：

1.准备：选择合适的滤菌器，通常使用孔径为0.45μm的薄膜滤菌器，使用前需对滤膜及收集滤液的容器进行高温灭菌处理，防止滤膜及容器上的微生物污染培养基。滤膜应定期检查更换，防止过滤效果降低。

2.过滤：将需要除菌的液体培养基在无菌条件下通过滤菌器进行过滤，以去除培养基中的微生物及芽孢。

3.收集：将过滤后的无菌培养基收集到无菌容器中，并密封保存备用。

图示为过滤除菌用滤膜

三、其他灭菌方法

除了上述两种常用的灭菌方法外，还有一些其他方法也可以用于液体培养基的灭菌，如紫外线灭菌、化学灭菌等。但这些方法通常具有局限性，如紫外线灭菌穿透力弱，只适用于空气及物体表面灭菌；化学灭菌可能残留有害物质，影响实验细胞的正常生长等，因此在实际应用中紫外线灭菌及化学灭菌较少采用。

四、注意事项

1.灭菌时间：高压蒸汽灭菌时间不宜过长或过短，过长可能导致培养基中的营养成分被破坏，过短则可能无法杀灭微生物及芽孢。

2.温度控制：在灭菌过程中应严格控制温度，确保达到所需的灭菌温度并保持足够的时间。

3.无菌操作：过滤除菌的整个过程要保持无菌操作，避免任何可能的污染。

4.保存条件：灭菌后的培养基应尽快使用，如需保存应置于适当的温度下（如10℃以下），并定期检查是否有污染现象发生。