微生物菌种的长期保藏策略与技术

关键词：菌种 菌种保藏 保藏时间 原理 斜面保藏 液体石蜡保藏 砂土管保藏 超低温保藏 冷冻干燥保藏 穿刺保藏

菌种保藏的目的是为了保持菌种的活性、不污染杂菌，同时防止其优良性状丢失，以便于随时为生产、科研提供优良菌种。菌种保藏的方法多种多样，但基本原理大多相同，主要是通过创造降低微生物代谢活动强度、生长繁殖受抑制、难以发生突变的环境条件来实现。以下是几种常见的菌种保藏方法：

1. 斜面保藏法

方法：在无菌条件下将需要保藏的菌种接种在合适的固体斜面培养基上，接种完毕的培养基放在培养箱或培养室中培养，待菌种生长成熟后，将培养基密封放至2-8℃的冰箱中保藏。保藏时间依微生物的种类而定，一般霉菌、放线菌及有芽孢的细菌可保存2-4个月，酵母菌可保存2个月，细菌可保存一个月。

优点：培养基定期配制可保证保藏的菌种新鲜有活力，且操作过程简单，培养基可随时用于生产或实验，人员能随时检查菌种的保藏情况。

缺点：保藏时间较短需定期接种；传代次数过多可能会使菌种发生变异，从而影响菌种的性状；接种和保藏过程中容易污染杂菌。

图示为斜面保藏法

2. 液体石蜡保藏法

方法：在无菌条件下，将已灭菌且水分已充分蒸发的石蜡倒入斜面培养基或穿刺培养物上，石蜡需高于培养基顶端1cm，以达到隔绝空气保藏菌种的目的。

优点：液体石蜡保藏法能适当延长菌种的保藏时间，可防止菌种因培养基水分蒸发而死亡，且不需要经常接种，保藏时间可达1-2年。

缺点：斜面必须直立保存，占用空间较大，不便携带。且石蜡制作方式复杂，接种时需充分冷却，防止石蜡飞溅引发安全事故。

图示为液体石蜡保藏法

3. 砂土管保藏法

方法：将河砂与非耕作层不含腐植质的瘦黄土或红土分分别洗净、烘干、过筛（一般河砂60目过筛，土100目过筛）后按2:1的比例装入10mmx100mm的小试管中，每支装量1g左右，塞上棉塞充分灭菌后即可用于菌种保藏。

优点：保藏时间较长，保藏效果好，使用起来操作方便。

缺点：操作步骤相对复杂，菌种可能因砂土处理不合格而无法保持活性。

图示为砂土保藏法

4. 超低温保藏法

方法：将甘油与纯化水配制成甘油浓度为10%-30%的保护剂，经高温灭菌后，在无菌条件下分装到5ml或2ml的冷冻管中，并将培养成熟且检测合格的菌种孢子用接种针刮下放入冷冻管中，于超低温冰箱（-50-80℃）或液氮（-196℃）中保藏。

优点：微生物在超低温环境下代谢基本停止，因此保存时间长，菌种不容易发生变异。

缺点：需要特殊设备，如超低温冰箱、液氮冷冻保藏器等，且操作相对复杂，液氮冷冻保藏对液氮的消耗量也较大。

图示为超低温保藏法

5. 冷冻干燥保藏法

方法：将培养成熟且检测合格的菌种在无菌条件下与保护剂制成细胞菌悬液，分装到安瓿瓶中，于超低温冰箱中快速冷冻，达到规定温度后对菌悬液进行减压抽真空干燥处理，然后在真空状态下对安瓿瓶融封，将安瓿瓶置于低温条件下保藏菌种。

优点：保存时间可达数年，便于携带，菌种不容易发生变异。

缺点：需要使用特殊设备和操作技术，成本较高。

图示为冷冻干燥保藏法

6. 穿刺保藏法

方法：准备好于试管中盛放的半固体培养基，培养基约为试管的1/3。无菌条件下用接种针挑选培养成熟且外观合格的单菌落，将接种针垂直刺入培养基中至接近底部，重复数次，接种完毕后密封试管，于适宜条件下培养合格后放至2-8℃冰箱中保存。

优点：操作简单，使用方便，保存时间较斜面保藏法相对较长。

缺点：培养基的营养成分不宜太过丰富，防止因菌种代谢而影响保存。

图示为穿刺保藏法

综上所述，菌种保藏方法多种多样，每种方法都有其优缺点。在选择保藏方法时，应根据微生物的种类、实验室条件以及保藏时间的长短等因素综合考虑。